ИЗМЕНЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КОПИЙ ГЕНОВ ПРИ МАЛИГНИЗАЦИИ ТКАНЕЙ ЛЕГКОГО
В настоящее время проблема ранней диагностики рака легкого остается нерешенной, а применяемые на современном этапе молекулярные маркеры не в полной мере удовлетворяют требованиям клиницистов-онкологов.
Исследование копийности генов может расширить наши представления о молекулярных механизмах, лежащих в основе малигнизации тканей легкого, и обеспечить данными, необходимыми для формирования панели новых высокоспецифичных онкомаркеров. Поэтому целью нашего исследования стало изучение изменений относительной копийности генов, ответственных за регуляцию апоптоза (BAX, BCL2, C-FLAR, P53, BFAR), пролиферацию (SOX2, OCT4, NANOG, PIK3 и MKI67), рецепцию эпидермального фактора роста (EGFR), окислительное фосфорилирование (HV2) и ответ на гипоксию (HIF1A1), для выявления высокоспецифичных онкомаркеров.
Материал и методы. Клиническим материалом для исследования послужили срезы тканей из FFPE-блоков 20 пациентов Юга России с гистологически подтвержденной ацинарной аденокарциномой легкого (G3). Срезы толщиной 3 мкм фиксировались на предметных стеклах, подвергались депарафинизации (о-ксилолом) и окрашивались гематоксилином-эозином. Из окрашенных препаратов с помощью лазерной микродиссекции (Palm MicroBeam, Carl Zeiss, Германия) выделялись опухолевые и нормальные клетки, из которых фенол-хлороформным методом проводилась экстракция ДНК. Определение относительной копийности 13 генетических локусов (BAX, HIF1A, OCT4, SOX2, BCL2, CFLAR, NANOG, P53, HV2, BFAR,
EGFR, PIK3 и MKI67) проводили методом RT-qPCR на термоциклере Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, США). Дизайн праймеров был осуществлен с использованием программного обеспечения GenBank NCBI/Primer-BLAST.
В качестве референсного гена использовали локус GAPDH. Для статистического анализа использовали критерий Манна – Уитни и коэффициент корреляции Спирмена.
Результаты. Обнаружено статистически достоверное (p < 0,05) снижение копийности генов BAX и EGFR на 18 и 61% соответственно и статистически достоверное (p < 0,05) увеличение копийности генов HIF1A1 и MDM2 на 31 и 189% в опухолевой ткани относительно нормальной. В опухолевой ткани легкого обнаружено снижение соотношения копийности генов р53/MDM2 в 3 раза по сравнению с нормальной тканью легкого при неизменной положительной корреляции. Соотношение копийности генов BAX/BCL2 в опухолевой и нормальной ткани практически не отличалось, но в опухолевой ткани наблюдалась поте-
ря положительной корреляции этих генов.
Выводы. Таким образом, изменение копийности генов BAX, MDM2, HIF1A1 и EGFR, соотношения копийности р53/MDM2 и корреляции BAX/BCL2 имеют большой потенциал в качестве молекулярных маркеров для прогнозирования течения и развития рака легкого. Изменение копийности про- (BAX) и антиапоптозных генов (MDM2), их соотношения (р53/MDM2) и корреляции (BAX/BCL2) может лежать в основе нарушения регуляции апоптоза, приводящего к его ингибированию в опухолевой ткани легкого. А повышение копийности гена HIF1A1 в опухолевой ткани отражает рост ее потенциала к ангиогенезу и мета-
Кит О.И., Кутилин Д.С., Водолажский Д.И.
В настоящее время проблема ранней диагностики рака легкого остается нерешенной, а применяемые на современном этапе молекулярные маркеры не в полной мере удовлетворяют требованиям клиницистов-онкологов.
Исследование копийности генов может расширить наши представления о молекулярных механизмах, лежащих в основе малигнизации тканей легкого, и обеспечить данными, необходимыми для формирования панели новых высокоспецифичных онкомаркеров. Поэтому целью нашего исследования стало изучение изменений относительной копийности генов, ответственных за регуляцию апоптоза (BAX, BCL2, C-FLAR, P53, BFAR), пролиферацию (SOX2, OCT4, NANOG, PIK3 и MKI67), рецепцию эпидермального фактора роста (EGFR), окислительное фосфорилирование (HV2) и ответ на гипоксию (HIF1A1), для выявления высокоспецифичных онкомаркеров.
Материал и методы. Клиническим материалом для исследования послужили срезы тканей из FFPE-блоков 20 пациентов Юга России с гистологически подтвержденной ацинарной аденокарциномой легкого (G3). Срезы толщиной 3 мкм фиксировались на предметных стеклах, подвергались депарафинизации (о-ксилолом) и окрашивались гематоксилином-эозином. Из окрашенных препаратов с помощью лазерной микродиссекции (Palm MicroBeam, Carl Zeiss, Германия) выделялись опухолевые и нормальные клетки, из которых фенол-хлороформным методом проводилась экстракция ДНК. Определение относительной копийности 13 генетических локусов (BAX, HIF1A, OCT4, SOX2, BCL2, CFLAR, NANOG, P53, HV2, BFAR,
EGFR, PIK3 и MKI67) проводили методом RT-qPCR на термоциклере Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, США). Дизайн праймеров был осуществлен с использованием программного обеспечения GenBank NCBI/Primer-BLAST.
В качестве референсного гена использовали локус GAPDH. Для статистического анализа использовали критерий Манна – Уитни и коэффициент корреляции Спирмена.
Результаты. Обнаружено статистически достоверное (p < 0,05) снижение копийности генов BAX и EGFR на 18 и 61% соответственно и статистически достоверное (p < 0,05) увеличение копийности генов HIF1A1 и MDM2 на 31 и 189% в опухолевой ткани относительно нормальной. В опухолевой ткани легкого обнаружено снижение соотношения копийности генов р53/MDM2 в 3 раза по сравнению с нормальной тканью легкого при неизменной положительной корреляции. Соотношение копийности генов BAX/BCL2 в опухолевой и нормальной ткани практически не отличалось, но в опухолевой ткани наблюдалась поте-
ря положительной корреляции этих генов.
Выводы. Таким образом, изменение копийности генов BAX, MDM2, HIF1A1 и EGFR, соотношения копийности р53/MDM2 и корреляции BAX/BCL2 имеют большой потенциал в качестве молекулярных маркеров для прогнозирования течения и развития рака легкого. Изменение копийности про- (BAX) и антиапоптозных генов (MDM2), их соотношения (р53/MDM2) и корреляции (BAX/BCL2) может лежать в основе нарушения регуляции апоптоза, приводящего к его ингибированию в опухолевой ткани легкого. А повышение копийности гена HIF1A1 в опухолевой ткани отражает рост ее потенциала к ангиогенезу и мета-
Кит О.И., Кутилин Д.С., Водолажский Д.И.
